In vitro sejtkultúrák használata asejtműködés modellezésére: aműanyag előnyei és hátrányai
In vitro sejtkultúrák használata asejtműködés modellezésére: aműanyag előnyei és hátrányai
Dr. Cervenak László
Semmelweis Egyetem, III. Sz. Belgyógyászati Klinika
Kutatólaboratórium
Elméleti PhD Iskola Kurzusa- Molekulától a betegágyig, sejttől aszervezetig
2011/2012 Tanév
Miért kutatunk?
Az élővilág (köztük az ember) jobbmegismerése
Betegségek kialakulásának megismerése
A gyógyítás lehetőségeinek megismerése
MEGISMERÉS
A megismerés szintjei
In vivo: Élő szervezetben végrehajtottvizsgálat
Ex vivo: A nemrég még élő szervezetegy szervének az élőn kívüli, általunkjobban kontrollált vizsgálata
In vitro: A valaha élő szervezet egyszövetének, sejtjeinek vizsgálata, aszervezettől merőben eltérőkörülmények között
In silico: A fentiek adatainakfelhasználásával, számítógépsegítségével történő modellezés
A megismerés szintjei
In vivoEx vivoIn vitroIn silico
Relevancia
Variabilitás
Kivitelezhetőség
Etikai problémák
Költségek
In vitro sejtkultúrák
Mi kell hozzá?
Megfelelő sejt
Sejttenyésztő tápfolyadék/táptalaj
Sejttenyésztő edény
Kontrollált körülmények – termosztát
Kezeléshez sterilfülke (lamináris légáramlású)
Hosszú távú tárolás (fagyasztás)
In vitro sejtkultúrákhoz alkalmazkodó analitikai módszerek
Megfelelő sejt kiválasztása
Eredet(organizmus,szerv, szövet)
Primer izolátumvs. immortalizáltsejtvonal
Hozzáférhetőség(nem csakegyszeri…)
Tenyészthetőség(egyszerű vagykörülményes)
Irodalmi adatokaz adott sejtről(0 – 1 000 000)
Tapasztalatainkhasonlósejtekkel?
Jó modellje-e avizsgálandófolyamatnak?
Fertőzésikockázat (a többisejt/ kísérletező)
?
?
Tápfolyadék – médium
Különböző komplettségi szintek
Minimum: Izotóniás sóoldat, pufferelt, cukor
Rövid távú kísérletek, ahol a fehérjék zavarhatnak
Normál: Izotóniás sóoldat, aminosavak, vitaminok,nyomelemek, cukor, glutamin (tápanyagként),szérum (borjú, vagy ritkábban fajazonos), növekedésifaktorok, indikátor
Általános sejttenyésztés
Speciális: Szérummentes, többféle hormonnal,szérumfehérjékkel kiegészített normál médium, dereceptje ált. üzleti titok
Speciális körülményeket igénylő sejtek, kísérletek
Tápfolyadék – médium
DMEM KOMPONENSEK
Inorganic Salts
CaCl2
Fe(NO3)3 • 9H2O
MgSO4
KCl
NaHCO3
NaCl
NaH2PO4
Amino Acids
L-Arginine • HCl
L-Cysteine • 2HCl
L-Glutamine
Glycine
L-Histidine • HCl • H2O
L-Isoleucine
L-Leucine
L-Lysine • HCl
L-Methionine
L-Phenylalanine
L-Serine
L-Threonine
L-Tryptophan
L-Tyrosine • 2Na • 2H2O
L-Valine
ADD
L-Glutamine
Vitamins
Choline Chloride
Folic Acid
myo-Inositol
Niacinamide
D-Pantothenic Acid • ˝Ca
Pyridoxine • HCl
Riboflavin
Thiamine • HCl
Other
D-Glucose
HEPES
Phenol Red • Na
Pyruvic Acid • Na
Hank’s Balanced Salt Solution
Inorganic Salts
CaCl2•2H2O
MgSO4
KCl
KH2PO4
NaHCO3
NaCl
Na2HPO4
OTHER
D-Glucose
pH 4,0 7,4 9,0
Sejttenyésztő edény
Feloszthatók
Típus/forma
Felület nagysága
Felület formája
Felület minősége
Felhasználási terület szerint
Sejttenyésztő edény
Petri-csésze
Sokféle átmérővel, falmagassággalés felszínnel gyártják, de nem mindalkalmas sejttenyésztésre!!!
Előnyök: egyszerű, olcsó, jógázcsere, a sejtek jól kinyerhetőekbelőle.
Hátrányok: könnyebbenbefertőződik, óvatosan kellmanipulálni.
Sejttenyésztő edény
Flaska
Sokféle felszínnel gyártják, aműanyag kémiai kezelése ésbevonata is különbözhet. Lehetszűrős vagy zárt kupakkal.
Előnyök: könnyebb sterilentartani, manipulálni.
Hátrányok: nehezebb asejtekhez való hozzáférés,rosszabb gázcsere, drága
Sejttenyésztő edény
Sejttenyésztő lemez (plate)
Sokféle geometria, lyukszám,felület és bevonat, nem mindalkalmas sejttenyésztésre!!!
Előnyök: Standard külsőméretek miatt automatizáltkezelés és analízis, egyszerűkezelhetőség, sokféle igényheztalálható megfelelő lemez
Hátrányok: szisztematikus hibalehetősége (széli hatás)
Sejttenyésztő edény
Speciális tenyésztőedények
Sejthozam növelés
Sejttenyésztő edény
Speciális tenyésztőedények
Analitikai fejlesztés
Sejttenyésztő edény
Speciális tenyésztőedények
Analitikai fejlesztés
Transwell plate
e-plate
Sejttenyésztő edény
A felszín fontossága
Kémiai kezelés
Felszín
Sejt adhézió
Hidrofób
Alacsony
Nemionos hidrofil
Nagyon alacsony
Negatív hidrofil
Ált. jó-nagyon jó
Pozitív hidrofil
Változó
Speciális
Sejtfüggő
Biológiai bevonat
Zselatin
Endotél
Poli-D-Lys
Simaizom
Matrigel
3D tenyészet
Kontrollált körülmények – termosztát
Humán (ill. emlős, madár) sejtek eseténszabályozandó környezeti faktorok:
Hőmérséklet (humán 37˚C, egér 38˚C, madarak 41-43˚C)
Páratartalom 100%
CO2 koncentráció általában 5%
pH enyhén lúgos (7,2-7,4)
A többi környezeti faktor stabilitását nem a termosztát, hanem asejttenyésztő médium, ill. annak megfelelő cseréje biztosítja!
Hosszú távú tárolás (fagyasztás)
Folyékony nitrogén vagy nitrogénnel hűtött tároló
cél: víz üvegesedési hőmérsékleténélalacsonyabb hőmérséklet
DMSO, glicerin – megakadályozzák azintracelluláris jégkristály képződést
1-2h tárolás -70˚C-on, majd áthelyezés avégleges tárolóba
kontrollált hűtés: 1˚C/min (speciális fagyasztó)
olvasztás gyorsan, csak 4-10˚C-ig, mert akrioprotektív adalékok mérgezők
Analitika
Analitika
Előnyök - hátrányok
Előnyök
Jól standardizálható
Nagy áteresztőképesség (sokminta kísérletenként)
Statisztikai biztonság (sokpárhuzamos kísérletenként)
Kísérleti körülmények rugalmasmegválasztása
Nagy módszertani repertoár
Egyszerűbb, lecsupaszítottmodellek (kevesebb változóval kellszámolni)
Más módszerekkel nemmegválaszolható kérdésektisztázása
Hátrányok
Az in vivo szituációktól erősen eltud térni!
Statikus (bár áramlási isegyre népszerűbb)
Kevés sejt-sejt kapcsolat
Nincs idegrendszeriszabályozás
Nincs immunrendszer (ezértantibiotikumok alkalmazásaáltalános)
Hipoproteinémiás közeg
Nagy kezdeti beruházást igényel
Köszönöm a figyelmet!