Application GuidelineApplication Guideline
PHANETRIabout the methods applied during the PHANETRI project
UputstvoUputstvo
PHANETRIza metode primenjene u okviru PHANETRI projekta
Alkalmazási Útmutató Alkalmazási Útmutató
PHANETRIa PHANETRI projekt keretében alkalmazott módszerekről
PHANETRIPHANETRI
Development of an in field, ecologically safe,continuously detoxifying technology for producingbio-vegetables
HUSRB/1002/214/068
Razvoj ekološke tehnologije sa kontinualnomdetoksifikacijom zemljišta za proizvodnju bio-povrća upoljskim uslovima
Szabadföldön alkalmazható, ökológiailag biztonságos,folyamatosan detoxifikáló technológia kifejlesztésebio-zöldségek termesztésére
University of Szeged, Faculty of Science and Informatics, Szeged,Hungary
Szegedi Tudományegyetem, Természettudományi és InformatikaiKar, Szeged, Magyarország
Departman za mikrobiologiju, Fakultet prirodnih nauka iinformаtike, Univerzitet u Segedinu, Segedin, Mađarska
PHANETRIPHANETRI
Guideline on methods applied in
The aim of the project was the development of an in field, ecologically safe, continuouslydetoxifying technology for producing bio-vegetables. The developed strategy is based on twocomponents: a polyphenol oxidase secreting Trichoderma strain with mycoparasitic capabilitiesand the capability to elicit the systemic acquired resistance system in plants, and a Phanerochaetechrysosporium strain capable to degrade a wide spectrum of pollutants.
A projekt célja egy szabadföldön alkalmazható, ökológiailag biztonságos, folyamatosandetoxifikáló technológia kifejlesztése volt bio-zöldségek termesztésére. A kidolgozott stratégia kétkomponensből áll: egy polifenol-oxidázt szekretáló, mikoparazita képességekkel rendelkezőTrichoderma törzsből, mely képes a növények szisztémikus szerzett rezisztencia-rendszerénekindukciójára, és egy Phanerochaete chrysosporium törzsből, mely a szennyezőanyagok szélesspektrumának lebontására képes.
Cilj projekta je razvoj ekološke tehnologije sa kontinualnom detoksifikacijom zemljišta zaproizvodnju bio-povrća. Razvijena strategija se oslanja na dve komponente: enzim polifenoloksidazu koji proizvode gljive iz roda Trichoderma sa mikoparazitičkim osobinama isposobnostima da izazovu sistemski stečenu otpornost kod biljaka kao i soj Phanerochaetechrysosporium koji može da razgradi širok spektar zagađivača.
Activities of the project
A special fungal strain collection containingdistinct Phanerochaete and Trichoderma strainsisolated from soil samples was established.
The best laccase producer fungi were identifiedin this collection with molecular methods.
The xenobiotic-degrading capabilities of thefungal strains in this collection was examined.
The antagonism spectra of the bestTrichoderma strains against phytopathogenicfungi was explored.
The detoxifying activities of the bestPhanerochaete and Trichoderma strains werestudied.
The Systemic Acquired Resistance elicitingcapabilities of the best Trichoderma strains wasexplored in tomato and pepper plants.
22
A projekt tevékenységei
Talajmintákból izolált, különböző Phanero-chaete és Trichoderma törzseket tartalmazóspeciális gomba törzsgyűjteményt hozunk létre.
A gyűjtemény legjobb lakkáztermelő gombáitmolekuláris módszerekkel azonosításítottuk.
Felmértük a gyűjteménybe került gomba-törzsek xenobiotikum-bontó képességeit.
Feltérképeztük a legjobb Trichoderma törzseknövénypatogén gombákkal szembeni antagoniz-mus-spektrumát.
Vizsgáltuk a legjobb Phanerochaete ésTrichoderma törzsek detoxifikáló aktivitását.
Felmértük a legjobb Trichoderma törzsekszisztémikus szerzett rezisztencia kiváltásáravaló képességét paradicsom- és paprika-növényeken.
Aktivnosti tokom trajanja projekta
Osnovana je nova kolekcija sojeva gljiva, iz roda Phanerochaete i Trichoderma izolovanih iz uzorakazemljišta.
Primenom molekularnih metoda su identifikovani sojevi gljiva iz nove kolekcije, koji sunajbolji proizvođači peroksidaza i lakaza.
Ispitana je sposobnost razgradnje ksenobiotika sojeva gljiva iz ove kolekcije.
Antagonističke sposobnosti najboljih sojeva gljiva Trichoderma prema fitopatogenim gljivama je istražena.
Sposobnost detoksifikacije zagađivača je proučena među najboljim sojevima Phanerochaete andTrichoderma.
Sposobnost indukcije sistemski stečene otpornosti gljiva roda Trichoderma je ispitana na paprici iparadajzu.
33
PHANETRIPHANETRI
Experimental conditionsExperimental conditions
Eksperimentalni usloviEksperimentalni uslovi
Kísérleti körülményekKísérleti körülmények
Molecular identification of Trichoderma andPhanerochaete strainsMolecular identification of Trichoderma andPhanerochaete strains
The fungal DNA extractions can be carried out from freshmycelia with Aqua Genomic Solution Kit, according tothe manufacturer’s instructions. The identification of theisolates can be performed by amplification and partialsequence analysis of the internal transcribed spacer(ITS) region, using universal primers ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) and ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) according toWHITE et al. (1990). Sequence analyses can be carriedusing the NCBI BLAST program (ALTSCHUL et al., 1990,http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) or in the case ofTrichoderma isolates, with the aid of the TrichOKEY 2.0online identification programme (DRUZHININA et al.2005).
Plates containing guaiacol- (A) and ABTS (B, C) used as indicatorsof laccase production
Lakkáztermelés kimutatására alkalmazott guajakol- (A) ésABTS(B,C) -tartalmú táplemezek
Petri kutije sa gvajakolom- (A) i ABTS (B, C) koji su korišteni kaoindikatori proizvodnje lakaze
Trichoderma és Phanerochaete törzsekmolekuláris azonosításaTrichoderma és Phanerochaete törzsekmolekuláris azonosítása
A gombaizolátumok DNS-ének kivonása friss micéliumbóltörténik az Aqua Genomic Solution Kit, felhasználásával, agyártó utasításai szerint. Az izolátumok azonosítása a köztesátíródó elválasztó (ITS) régió amplifikálásával és részlegesszekvenciaelemzésével történhet az ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) és ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) univerzálisindítószekvenciák felhasználásával WHITE és mtsai. (1990)szerint. A szekvenciaelemzések az NCBI BLAST program(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST, ALTSCHUL és mtsai.,1990) felhasználásával, illetve Trichoderma izolátumokesetében a TrichOKEY 2.0 online elérhető azonosítóprogram (DRUZHININA et al. 2005) segítségévelkivitelezhetők.
Molekularna identifikacija sojevaTrichoderma i Phanerochaete Molekularna identifikacija sojevaTrichoderma i Phanerochaete
Sequence chromatogram of a fungal ITS region
Egy gomba ITS-régiójának szekvenciakromatogrammja
Hromatogram sa sekvencama ITS regiona kod gljiva
Ekstrakcija DNK iz gljiva može biti urađena iz svežihmicelija upotrebom Aqua Genomic Solution Kit-a, premauputstvima proizvođača. Identifikacija izolata se izvodiamplifikacijom i parcijalnom analizom sekvence ITSregiona, upotrebom univerzalnih ITS4 (5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’) i ITS5 (5’-GGAAGTAAAAGTCGTAACAAGG-3’) prajmera premaradu WHITE et al. (1990). Analize sekvenci izvode seupotrebom NCBI BLAST programa (ALTSCHUL et al.,1990, http://www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST) ili u slučajusojeva Trichoderma korišćenjem TrichOKEY 2.0 onlineprograma za identifikaciju (DRUZHININA et al. 2005).
A
B
C
Screening for laccase productionScreening for laccase production
Skrining za produkciju lakazeSkrining za produkciju lakaze
For the screening for laccase-producing fungal strain, themedium contains: 0.5 % glucose, 0.1 % yeast extract, 0.1 %Na2HPO4, 0.2 % KH2PO4 and 2 % agar. Guaiacol or ABTSare to be added for indicating the laccase activity.
Za skrining sojeva koji proizvode lakazu koristi se podlogakoja sadrži: 0.5 % glukozu , 0.1 % ekstrakt kvasca, 0.1 %Na2HPO4, 0.2 % KH2PO4 i 2 % agar. Gvajakol ili ABTS jepotrebno dodati za dokazivanje aktivnosti lakaze.
Lakkáztermelés vizsgálataLakkáztermelés vizsgálata
A gombatörzsek lakkáztermelésének kimutatására alkalmazotttáptalaj 0,5 % glükózt, 0,1 % élesztőkivonatot, 0,1 %Na2HPO4-ot, 0,2 % KH2PO4-ot és 2 % agart tartalmazott,guajakollal vagy ABTS-el kiegészítve.
44
PHANETRIPHANETRI
Experimental conditionsExperimental conditions
Eksperimentalni usloviEksperimentalni uslovi
Kísérleti körülményekKísérleti körülmények
Studies on the in vitro antagonismof Trichoderma isolatesStudies on the in vitro antagonismof Trichoderma isolates
The in vitro antagonistic properties of theTrichoderma isolates against plantpathogenic fungi were examined on yeastextract glucose (YEG) agar at 25 °C. Agardiscs (5 mm in diameter) cut from thegrowing front of 3-day-old colonies of theplant pathogen pregrown on YEG wereinoculated onto the surface of media in Petriplates of 9 cm in diameter. After 24 h,mycelial discs of 2-day-old Trichodermacolonies were inoculated in the same way, 3cm apart from the plant pathogens. Theinoculation of Trichoderma strains wascarried out in the most precise way in orderto ensure the same available space for bothfungi. Images (1800 × 1200) taken 10 daysafter the inoculation of Trichoderma weresubjected to image analysis by the ScionImage v4.02 software. Biocontrol index(BCI) values were calculated as follows:BCI = (area of Trichoderma colony / totalarea covered by Trichoderma and the plantpathogenic fungus) × 100 (SZEKERES etal. 2006).
Trichoderma izolátumok in vitroantagonizmusának vizsgálataTrichoderma izolátumok in vitroantagonizmusának vizsgálata
Schematic illustration of theprocedure used for BCI determination
A BCI meghatározására alkalmazottmódszer sematikus ábrázolása
Shema procedure koja se koristi kododređivanja BCI
A Trichoderma izolátumok növénypatogéngombák elleni in vitro antagonistaképességeinek vizsgálata élesztőkivonat-glükózos agaron (YEG) történt 25 °C-on. Anövénypatogén gombák YEG táptalajonelőnevelt, 3 napos telepeiből kivágott, 5 mmátmérőjű agarkorongokat 9 cm-es Petri-csészékbe öntött táptalaj felszínére helyeztük.24 óra után 2 napos Trichodermatenyészetekből ugyanúgy történt azinokuláció, a növénypatogén gomba oltásipozíciójától 3 cm-es távolságra. ATrichoderma törzsek leoltása a lehetőlegprecízebb módon történt annak érdekében,hogy mindkét gomba számára ugyanannyiterület álljon rendelkezésre. A Trichodermaleoltása után 10 nappal 1800×1200 pixelesfelbontású fényképeket készítettünk, melyekera Scion Image v4.02 szoftverrel végrehajtottképanalízissel elemztünk. A biokontroll index(BCI) értékeket a következőképpenhatároztuk meg: BCI = (a Trichoderma telepterülete / a Trichoderma és a növénypatogéngomba által együttesen elfoglalt terület) × 100(SZEKERES és mtsai. 2006).
In vitro antagonističke sposobnosti sojeva roda Trichoderma prema fitopatogenim gljivama je ispitan na agaroznoj podlozi saglukozom i ekstraktom kvasca (yeast extract glucose- YEG) na 25 °C. Diskovi veličine 5 mm u prečniku su isecani iz agara nakome su se razvile kolonije fitopatogena stare 3 dana i inokulisane su na površinu YEG podloge u petri posude prečnika 9 cm.Nakon 24 h diskovi micelija 2 dana starih kolonija Trichoderma su inokulisane na isti način, ali 3 cm udaljene od inokuilisanogfitopatogena. Inokulacija sojeva Trichoderma je izvedena na veoma precizan način kako bi se obezbedio potreban proces zarast obe gljive. Slike (1800×1200) fotografisane 10 dana nakon inokulacije Trichoderma-e su analizirane upotrebom ScionImage v4.02 softvera. Vrednosti indeksa biokontrole (BCI) su računate na osnovu formule: BCI = (prostor zauzet kolonijamaTrichoderma/ ukupna površina zauzeta kolonijama Trichoderma i fitopatogena) × 100 (SZEKERES et al. 2006).
Proučavanje in vitro antagonizma sojeva gljive Trichoderma Proučavanje in vitro antagonizma sojeva gljive Trichoderma
Trichodermaasperellum
Fusariumsolani
Trichodermaatroviride
Botrytiscinerea
55
PHANETRIPHANETRI
Experimental conditionsExperimental conditions
Eksperimentalni usloviEksperimentalni uslovi
Kísérleti körülményekKísérleti körülmények
Application technology – plant- soil- fungi interaction
In the pot experiment 635 g of soil mixture was prepared (1:1:5 Vratio of soil:sand:peat ). Watering regime: 75 % of soil mixturewater capacity. Lighting 14h day/ 10h night.
1 ppm of AFALONE active substance - linurone solution wasapplied in the pot and in the field experiment. After 2 daysPhanerocheate spore suspension (8x106 cfu) was added into soilplanting space. Tomato and lettuce were transplanted 7 days afterand Trichoderma spore suspension (2.5x105 cfu ) was added tothe soil. Plant growth parameters were measured and linuroneconcentration in the soil samples was determined.
Determination of linurone in soil:
Soil samples were taken in pot and field experiments in 10replicates. For determination of AFALON active substance-linuronthe chromatographic system was used (Agilent chromatograph,Agilent 1220 Infinity LC).The column was a stainless steelPhenomenex Synergy 2,5 µ Fusion RP 100 A (50 mm x 2,1mmI.D.). The chromatographic conditions were as follows: eluent,methanol-water (65:35, v/v); flowrate, 0.4 ml/min; injection volume,10 µl; wavelength, 254 nm. Column temperature was ambient.
To obtain a solution of extractable linurone, 0.5 g of soil wasshaken with 5 ml of water over 24 h. The suspension was thencentrifuged at 14000 rpm for 30 min and the aqueous extract wasseparated.
The response of the detector as referred to peak areas was linearin the range assayed (0.1-1.2 µg//ml) and least squares linearregression analysis of the data provided an excellent correlation(R2=0.999). LOD was 0,03 µg/ml or 0,3 µg/g of soil.
Tehnologija primene metode – interakcija biljka-zemljište-gljiva
Saksije su sadržale 635 g smeše pripremljene od zemljišta, peskai treseta u zapreminskom odnosu 1: 1: 5. Biljke su zalivane do75% maksimalnog vodnog kapaciteta. Režim osvetljavanja je bio14h dan/10h noć. Aktivna supstanca AFALONA- linuron (1ppm) jedodat na zemljište u saksijama i na polju. Nakon 2 dana dodata jesuspenzija spora Phanerocheate (8x106 cfu). Paradajz i salata surasadjeni 5 dana posle, uz dodatak suspenzije Trichoderma(2.5x105 cfu ). Mereni su parametri rasta biljaka i određivana jekoncetracija linurona u uzorcima zemljišta.
Određivanje linurona u zemljištu:
U okviru ekperimenata u saksijama i na polju, uzimani su uzorcizemljišta u 10 ponavljanja. Za merenje koncentracije linuronakoristio se hromatografski sistem Agilent (Agilent 1220 Infinity LC).Primenjena je kolona Phenomenex Synergy 2,5 µ Fusion RP 100A (50 mm x 2,1mm I.D.) od nerđajućeg čelika. Uslovi razdvajanjasu bili sledeći: eluent, metanol-voda (65:35, v/v); brzina protoka,0.4 ml/min; zapremina uzorka, 10 µl; talasna dužina 254 nm,sobna temperatura. Priprema uzoraka za analizu- 0.5 g zemljištaje mućkano u 5 ml vode 24 h. Suspenzija je centrifugirana na14000 rpm 30 min i vodeni eksrakt je odvojen.
Odgovor detektora,(površina ispod vrha krive) je bio linearan uispitivanom opsegu (0,1-1,2 µg//ml). Regresiona analiza najmanjihkvadrata, izmerenih standarda pokazala je odličnukorelaciju.(R2=0.999). LOD je bio 0,03 µg/ml ili 0,3 µg/g of soil.
Chromatogram obtained for extract of soil spiked with 1 µglinurone
1 µg linuronnal adalékolt talaj kivonatára kapott kromatogramm
Hromatogram ekstrakta zemljišta u koji je dodat 1 µg linurona
Alkalmazástechnológia – növény- talaj- gombakölcsönhatás
A cserepes kísérletben 635 g talajkeveréket készítettünk(talaj:homok:tőzeg 1:1:5 V arányú keveréke). Öntözésikörülmények: a talajkeverék vízkapacitásának 75 %-a.Fényviszonyok: 14 óra nappal/ 10 óra éjszaka.
Az AFALON aktív hatóanyagából, a linuronból 1 ppm-esoldatot alkalmaztunk a cserepes és szabadföldikísérletekben. Két nap elteltével Phanerocheatespóraszuszpenzióval (8x106 cfu) kezeltük az ültetésiterületet. A paradicsom- és salátanövények ültetése eztkövetően 7 nappal történt, ugyanekkor történt a talajTrichoderma spóraszuszpenzióval (2.5x105 cfu ) valókezelése is. A növények növekedési paraméterei, valamint alinuron koncentrációja a talajban meghatározásra kerültek.
A linuron meghatározása a talajban:
A cserepes és szabadföldi kísérletekben a talajmintavétel 10párhuzamosban történt. Az AFALON aktív hatóanyagának, alinuronnak a meghatározása kromatográfiás technikával(Agilent 1220 Infinity LC rendszer) történt, saválló acélPhenomenex Synergy 2,5 µ Fusion RP 100 A (50 mm x2,1mm I.D.) oszlopon. A kromatográfiás körülmények akövetkezők voltak: eluens, metanol-víz (65:35, v/v); áramlásisebesség, 0.4 ml/min; injektálási térfogat, 10 µl; hullámhossz,254 nm. Az oszlop szobahőmérsékleten volt termosztálva.
Az extrahálható linuron kinyerésére 0,5 g talajt rázattunk 5 mlvízzel 24 órán át. A szuszpenziót ezt követően 14000 rpmsebességgel 30 percig centrifugáltuk, és leválasztottuk avizes fázist.
A vizsgált tartományban (0,1-1,2µg//ml) a detektorjel(csúcsterület) és a koncentráció közötti összefüggéslineárisnak bizonyult, és a legkisebb négyzetek módszerévelvégrehajtott lineáris regressziós analízis korrelációsegyütthatója kiválónak bizonyult (R2=0.999). A LOD érték0,03 µg/ml-nek, vagy 0,3 µg/g talajnak adódott.
66
PHANETRIPHANETRI
References/Literatura/IrodalomReferences/Literatura/Irodalom
ALTSCHUL S.F., GISH W., MILLER W., MYERS E.W., LIPMAN D.J. (1990): Basic local alignmentsearch tool. Journal of Molecular Biology 215, 403-410.
DRUZHININA i., KOPCHINSKIY A.G., KOMON M., BISSETT J., SZAKÁCS G., KUBICEK C.P.(2005): An oligonucleotide barcode for species identification in Trichoderma and Hypocrea.Fungal Genetics and Biology 42, 813-828.
SZEKERES A, LEITGEB B, KREDICS L, MANCZINGER L, VÁGVÖLGYI C (2006) A novel, imageanalysis-based method for the evaluation of in vitro antagonism. J Microbiol Methods 65,619-622.
WHITE T.M., BRUNS T., LEE S., TAYLOR J. (1990): Amplification and direct sequencing offungal ribosomal RNA for phylogenetics. In: INNIS M.A., GELFAND D.H., SNINSKY J.J.,
WHITE T.J. (Eds.). PCR protocols: a guide to methods and applications. Academic Press, SanDiego, CA, pp. 315-321.
This document has been produced with the financial assistance of the European Union.The content of the document is the sole responsibility of the KNRET and the Departmentof Microbiology, Faculty of Science and Informatics, university of Szeged, Hungary andcan under no circumstances be regarded as reflecting the position of the EuropeanUnion and/or the Managing Authority.
Ovaj dokument je odštampan uz finansijsku podršku Evropske unije. Za sadržaj ovogdokumenta je odgovoran isključivo Departman za mikrobiologiju, Fakultet za nauku iinformatiku i KNRET, Univerzitet u Segedinu, Mađarska i sadržaj ovog dokumenta neodražava zvanično mišljenje Evropske unije i/ili Direktorata.
Ez a dokumentum az Európai Unió pénzügyi támogatásával valósult meg. Adokumentum tartalmáért teljes mértékben a Szegedi Tudományegyetem, KNRET és aTTIK, Mikrobiológiai Tanszék, Magyarország vállalják a felelősséget, és az semmilyenkörülmények között nem tekinthető az Európai Unió és / vagy az Irányító Hatóságállásfoglalását tükröző tartalomnak.
